Como marcadores no sangue podem prever a gravidade da covid-19

Desde que o novo coronavírus emergiu, em dezembro de 2019, cientistas do mundo todo têm se debruçado em decifrar a patogênese do Sars-CoV-2 – o mecanismo pelo qual o vírus desenvolve a doença em humanos. Em três estudos publicados recentemente, pesquisadores brasileiros realizaram descobertas importantes: marcadores presentes nas células e no sistema vascular no estágio inicial da doença que podem indicar a gravidade da covid-19 que o paciente desenvolverá.

Uma dessas pesquisas, realizada na Universidade de Yale, nos Estados Unidos, encontrou cinco tipos de citocinas no estágio inicial da covid-19. A quantidade dessas pequenas proteínas presentes na célula, que agem como sinalizadoras da resposta imune, podem apontar se o paciente terá um quadro moderado ou severo da doença. Esses marcadores podem ser observados entre o nono e o 12º dia após a aparição do primeiro sintoma.

“O desenvolvimento de um quadro clínico mais grave da doença está relacionado não apenas com a carga viral, mas também com uma disfunção da resposta imunológica”, observa Carolina Lucas, uma das investigadoras principais do estudo publicado na revista científica Nature, em 27 de julho. “Além disso, conseguimos detectar marcadores imunológicos séricos presentes no sangue em uma fase inicial da doença. Isso poderia auxiliar no direcionamento do tratamento do paciente em futuras intervenções clínicas.”

Carolina é formada em microbiologia pela Universidade Federal do Rio de Janeiro (UFRJ), onde também fez mestrado em imunologia e licenciatura em biologia. Em 2018, a brasileira foi contemplada com uma bolsa do fundo PEW para cientistas latino-americanos conduzirem pesquisas no exterior. Desde então, trabalha no Departamento de Imunobiologia da Universidade de Yale, em New Haven, no estado de Connecticut.

Ao longo da carreira, a cientista brasileira concentrou-se na resposta imune contra infecções virais, como HIV-Aids, Zika e Chikungunya. Com a chegada do coronavírus aos Estados Unidos, foi escalada para coordenar a criação de um banco de amostras de sangue, saliva e urina de pacientes com covid-19 que dessem entrada no hospital de Yale em New Haven.

A partir desse acervo, pesquisadores de diferentes áreas puderam investigar o Sars-CoV-2. A equipe em que Carolina trabalha voltou-se para as características da resposta imunológica. No estudo publicado na Nature, eles avaliaram 113 pacientes com covid-19 moderada ou severa, entre 18 de março e 27 de maio. Um grupo controle também participou do ensaio clínico, formado por médicos, enfermeiros e outros profissionais da saúde que não haviam contraído o vírus.

O pico da carga viral acontece em torno de dez dias após a infecção e é similar em ambos quadros clínicos. Logo após, contudo, ocorre uma bifurcação que indicará o curso da doença. Enquanto o paciente que terá uma trajetória leve controla a carga viral, aquele que possui marcadores de covid-19 apresentam um controle deficitário, mais lento da carga viral. Isso resulta em uma disfunção da resposta imune que coincide com o agravamento do quadro clínico, com a necessidade de admissão em unidade de terapia intensiva (UTI) e maior suplementação de oxigênio.

Os pesquisadores de Yale consideram que essa falta de controle do vírus esteja relacionada com o aumento e descontrole de múltiplas citocinas. A resposta imunológica divide-se nos tipos 1, 2 e 3, explica Carolina. A primeira consiste em uma resposta clássica contra patógenos intracelulares, como é o caso dos vírus. Já a ação contra infecções ocasionadas por helmintos ou fungos, por exemplo, estão mais relacionadas aos tipos 2 e 3. Quando entra na célula, o Sars-CoV-2 deixa o mecanismo imune desorientado nos casos mais graves. Além da resposta de tipo 1, os pacientes que evoluíram para quadros severos estavam com elevados marcadores dos tipos 2 e 3. Essa mistura está diretamente associada com o agravamento da doença e também atrapalha no direcionamento da resposta mais adequada, de tipo 1.

“Eles apresentam como se tivessem um quadro alérgico, mais visto no combate ao fungo. É como se seu sistema imune estivesse completamente disfuncional, além de poderem ter uma ação patológica direta”, analisa Carolina. “Como o vírus não consegue ser controlado, o patógeno está sempre presente e essas citocinas continuam sendo produzidas, com excesso em todos os braços [do sistema imune]." 

As três citocinas mais associadas aos quadros graves são as interleucinas 18 e 10 e o interferon. Esta última é uma citocina antiviral que desempenha uma série de funções para bloquear o patógeno e evitar que células vizinhas sejam infectadas, explica Carolina. Entretanto, os pesquisadores observaram que a citocina interferon, produzida por leucócitos (glóbulos brancos), é a segunda mais relacionada à fatalidades, caso esteja com nível elevado no começo da infecção. Esse papel patológico do interferon já foi identificado em doenças de outros coronavírus – o Sars-CoV-1 e o Mers –, assim como na inflamação exagerada em casos de influenza.

“É comum que os vírus induzam citocinas, mas isso tem que ser controlado para não gerar uma disfunção como está acontecendo”, avalia Carolina. “A [questão] é se o vírus realmente é o driver e, por não ser controlado, continua gerando essa citocina; ou se, por algum outro motivo, o corpo não está conseguindo controlar essa inflamação excessiva.”

Os estudos do grupo de Yale continuam. Os cientistas querem, por exemplo, descobrir a consequência da infecção em pacientes com alto índice de massa corpórea. Eles também estão analisando a resposta humoral (de anticorpos) e sua relação com a elevação de citocinas e outras complicações da doença, como coagulopatias. Além disso, entendem que, enquanto 113 pacientes são uma boa amostra para uma análise imunológica, mais voluntários de variados contextos serão necessários para novos ensaios clínicos.

Cascata de coagulação

Coagulação sanguínea e tromboses são patologias da covid-19 que preocupam a comunidade médica e científica desde o início da pandemia. Diante disso, pesquisadores da Fundação Oswaldo Cruz (Fiocruz) investigaram quais são os mecanismos, a nível das células e das moléculas, que desregulam a coagulação e resultam em maior risco de trombose e, não raro, em óbito.

O estudo foi coordenado por Eugênio Hottz, professor do Departamento de Bioquímica da Universidade Federal de Juiz de Fora (UFJF), e Patrícia Bozza, pesquisadora e chefe do Laboratório de Imunofarmacologia do Instituto Oswaldo Cruz. A pesquisa envolveu tanto instituições de pesquisa básica (Fiocruz e UFJF), quanto ensaios clínicos no Instituto D’Or de Pesquisa e Ensino e no Instituto Estadual do Cérebro, no Rio de Janeiro.

Os cientistas obtiveram amostras sanguíneas e respiratórias de 35 pacientes com covid-19 grave, em até 72 horas após a internação em UTI, quatro de pessoas com quadros leves e duas assintomáticas. Em laboratório, isolaram a célula e outros componentes do sangue, como plaquetas, monócitos e o plasma. Então, utilizaram ferramentas de citometria de fluxo e microscopia para identificar o estado das células e a interação entre esses componentes. Em paralelo, a equipe médica acompanhou a situação clínica dos voluntários por um mês.

Os primeiros resultados foram publicados na revista científica Blood, em 17 de julho. Os pesquisadores descobriram um dos meios responsáveis pela coagulação na covid-19. Pacientes graves apresentaram elevada ativação plaquetária e maior formação de agregados plaqueta-monócito. A partir dessas manifestações, aqueles com maiores níveis de ativação plaquetária evoluíram com necessidade de ventilação mecânica e até mesmo óbito. Ambos eventos não foram observados nem nas pessoas com formas brandas da doença – sem necessidade de internação –, nem nos assintomáticos. Aqueles que precisavam ser admitidos na UTI, mas tinham menor atividade plaquetária, tiveram alta hospitalar.

A identificação desses dois mecanismos no estágio inicial da doença “poderiam funcionar como um sinalizador de que um paciente tenha mais chance de evoluir com um quadro grave”, antes mesmo de apresentarem as patologias, explica Hottz. “Essa interação da plaqueta com o monócito induz no monócito a expressão do fator tecidual, uma proteína que funciona como iniciadora da coagulação sanguínea.”

Hottz é pesquisador colaborador do Laboratório de Imunofarmacologia da Fiocruz e autor principal do estudo. Na UFJF, ele é chefe do Laboratório de Imunotrombose. Lá, os pesquisadores investigam as maneiras como os sistemas imune e da coagulação interagem e se complementam em doenças como a dengue e, agora, a covid-19.

A coagulação consiste em um processo de cicatrização do organismo para impedir sangramentos, segundo Hottz. Contudo, “quando ocorre de maneira intravascular e descontrolada, esse agregado de plaquetas com proteínas do sangue pode gerar trombos”. E esses trombos podem entupir vasos sanguíneos.

O descontrole ocorre em casos que o quadro do paciente evolui a ponto de exigir ventilação mecânica ou óbito. Isso porque o fator tecidual gera a chamada cascata de coagulação, na qual uma proteína no sangue vai ativando a outra – são dez tipos de proteína de coagulação no total. O trombo acontece ao fim dessa cascata, quando a proteína fator-I é ativada e uma rede de fibrina se forma junto à plaqueta.

A complicação decorrente das tromboses depende da localização do entupimento. Quando ocorre na perna, por exemplo, pode levar à amputação do membro, pois ele deixa de receber nutrientes que circulam no sangue, como oxigênio. No cérebro, possibilita o derrame. Na artéria coronariana, infarto. No pulmão, embolia pulmonar. “Todas essas complicações têm sido relatadas em casos mais graves da covid-19, levando até mesmo ao óbito desses pacientes”, afirma Hottz. Os pesquisadores ainda querem investigar se a ativação da coagulação amplifica a inflamação e, dessa forma, complica ainda mais o quadro.

Segundo Hottz, a identificação das vias moleculares envolvidas no processo de coagulação deve auxiliar no tratamento dos pacientes graves. Com a descoberta, medicamentos para inativação de plaquetas já disponíveis podem ser testados como alternativas no tratamento de trombose nos caso de covid-19. Isso, evidentemente, requer novos ensaios clínicos.

Trombose em tempo real

A rotina tem sido intensa no Hospital das Clínicas (HC) da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, da Universidade de São Paulo (FMRP-USP). No processo de interiorização do novo coronavírus no estado, o HC é referência para casos graves na cidade. Praticamente todos os leitos de UTIs foram ocupados em julho. “Foram semanas difíceis”, conta Carlos Henrique Miranda, professor do Departamento de Clínica Médica da instituição.

Em paralelo ao atendimento na emergência, Miranda trabalha em pesquisas sobre a patogênese da covid-19. No mais recente, identificou, em tempo real, a presença de microtrombos nos pequenos vasos da região sublingual. O estudo foi publicado no Journal of Thrombosis and Thrombolysis, em 13 de agosto.

Até então, apenas ensaios post-mortem demonstravam a existência de microtrombos em pacientes diagnosticados com covid-19, observa Miranda. Com isso, ainda restava a dúvida se tais coágulos presentes, por exemplo, nos vasos do pulmão, tinham relação direta com a doença do novo coronavírus, ou eram resultado de uma coagulação intravascular disseminada, comum em pacientes que passam longos períodos internados em UTI.

Miranda já participava de outro estudo da faculdade, que avaliava a presença de microtrombose em pacientes com sepse de origem bacteriana. Para isso, tinham acabado de receber um vídeo-microscópio comprado com recursos da Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (Fapesp). Conforme a pandemia do novo coronavírus se alastrava para o interior, o médico decidiu analisar a presença desses microcoágulos na covid-19.

O estudo envolveu 13 pacientes internados no Hospital das Clínicas em estado grave, com insuficiência respiratória e necessidade de ventilação mecânica. A análise é feita na região sublingual por ser uma superfície mucosa e menos invasiva para realizar a observação da circulação sanguínea em pacientes vivos, diz Miranda. Por meio do vídeo-microscópio com luz polarizada, os pesquisadores conseguiram acompanhar o fluxo de sangue.

“O vaso é como um canudinho. Deve ser todo preenchido por hemácia”, ilustra Miranda. Logo no primeiro paciente, a equipe detectou falha de enchimento, o que sugeria presença de coágulo. O segundo apresentava quadro similar. No terceiro, por sua vez, os pesquisadores testemunharam a formação de um coágulo. O fluxo de sangue foi diminuindo até ser obstruído completamente, o que resultou no surgimento de um trombo. Dos 13 pacientes que participaram do estudo, 11 tiveram trombose.

“Do mesmo jeito que observamos debaixo da língua, o trombo deve ocorrer sistemicamente nos vasos do cérebro, do rim, do fígado, do pulmão”, acredita Miranda. “Pacientes com covid têm mostrado um estado de hipercoagulabilidade – facilidade para formar coágulos. Por isso, achamos que nos vasos dos outros órgãos isso deve acontecer também.”

Miranda considera que esses microtrombos podem contribuir para a piora do quadro clínico do paciente, pois dificulta ainda mais a oxigenação do sangue. Essas coagulações podem se estender para outras regiões do corpo e provocar disfunção múltipla dos órgãos, o que aumenta a mortalidade.

Mas o médico ressalta que esse é um trabalho inicial. Os pesquisadores precisam, agora, comprovar a evidência em um número maior de pacientes para determinar se isso tem “um papel importante no desencadeamento das complicações da doença”.

“A grande dúvida que temos hoje é se vale a pena ou não usar medicamentos anticoagulantes, que poderiam diminuir a formação desses coágulos e melhorar o desfecho dos pacientes”, observa Miranda. Quando o paciente é admitido na UTI, recebe uma dose baixa de Heparina, como profilaxia para evitar a formação de trombos. É um fármaco tradicional no tratamento de embolia pulmonar e infarto, mas que ainda não havia sido utilizado para doenças infecciosas como a covid-19.

“O que chamou a atenção é que, mesmo com essa dose baixinha, ocorria a formação dos trombos”, analisa o Miranda. Com isso, os médicos conduzem um ensaio clínico em que aplicam uma dose mais alta do anticoagulante, “para ver se protege da formação desses trombos e, assim, tem o benefício de melhorar os desfechos dos pacientes”.