Próximas vacinas talvez não precisem ser mantidas a temperaturas tão baixas

Foi uma atitude inocente: enquanto limpava o Hospital de Veteranos da cidade de Boston, nos EUA, em janeiro passado, um prestador de serviços bateu no plugue frouxo de um congelador e o deslocou da tomada. Esse erro simples resultou na perda de aproximadamente duas mil doses da vacina contra a covid-19 da Moderna, que estavam resfriando dentro do equipamento desconectado. Ainda que esse fato seja insignificante diante da escala mundial da vacinação, ele ilustra uma questão muito importante para muitas das vacinas contra a covid-19: a necessidade de mantê-las congeladas.

Duas das principais vacinas contra o novo coronavírus autorizadas para uso emergencial nos Estados Unidos — as vacinas da Moderna e da Pfizer/BioNTech — dependem de uma série de medidas dispendiosas de transporte e armazenamento com temperatura controlada, conhecida como cadeia de frio, desde a saída do fabricante até sua aplicação. Essas exigências rígidas de controle de temperatura também representam um obstáculo para a distribuição igualitária das vacinas, aumentando o custo e a dificuldade do transporte e cortando o acesso de comunidades remotas que não possuem eletricidade e refrigeração estáveis.

O motivo da exigência dessas condições gélidas é que o ingrediente principal da vacina — uma molécula chamada RNA mensageiro (mRNA) — é extremamente frágil e as temperaturas baixas desaceleram as reações químicas que podem rompê-lo. No entanto projetos promissores para reduzir esse fardo gelado já estão em andamento — e eles vão desde a manipulação da estrutura do mRNA até o transporte da vacina em forma sólida com um protetor açucarado.

Essas iniciativas não são importantes apenas para deter a pandemia atual. Cientistas consideram vantajosas as vacinas que utilizam mRNA para o tratamento de uma variedade de outras doenças, já que elas são facilmente ajustadas para variantes de vírus diferentes e também são desenvolvidas de forma rápida para novos vírus.

“Todas as medidas adotadas agora serão muito importantes nos próximos anos”, afirma Rein Verbeke, cientista farmacêutico da Universidade de Gante, na Bélgica, especializado em vacinas de mRNA.

Moléculas autodestrutivas

A necessidade de armazenamento em temperaturas baixas se deve ao componente principal do funcionamento dessas vacinas, que é o mRNA. Esses filamentos de código genético presentes na vacina contra a covid-19 contêm instruções que as células humanas utilizam para fabricar as proteínas de espícula, que se encontram na superfície do Sars-CoV-2. Essa prévia da proteína faz com que o sistema imunológico do organismo fique familiarizado com o vírus, para que ele o reconheça e combata futuras invasões de coronavírus.

O RNA mensageiro é parecido com um filamento único de DNA, mas sua estrutura possui uma diferença crucial: um grupo químico adicional, composto por oxigênio e hidrogênio, conhecido como hidroxila.

Se o filamento de RNA se dobrar de uma certa maneira, esse grupo hidroxila consegue interagir com outra parte da estrutura, provocando uma reação que fragmenta a cadeia genética, explica Hannah Wayment-Steele, acadêmica de PhD na Universidade de Stanford, que estuda a estrutura do RNA.

“Isso corta a mensagem no meio”, ela afirma. E essas mensagens mais curtas não conseguem formar uma proteína completa. “Um único corte no filamento do mRNA pode ser suficiente para perder sua função”, explica Verbeke, o cientista farmacêutico.

Para desacelerar a degradação, as empresas armazenam as vacinas em baixas temperaturas. Quanto mais baixa for a temperatura, mais lentos serão os movimentos moleculares — e as probabilidades de reações danosas serão mais baixas, prossegue Verbeke. A vacina da Pfizer/BioNtech precisa ser transportada em temperaturas abaixo de 80 graus negativos. Elas podem ser armazenadas em congeladores normais por até duas semanas, em refrigeradores por até cinco dias e, em temperatura ambiente, por apenas seis horas. A vacina da Moderna é um pouco mais flexível. Ela permanece estável por até seis meses em um congelador normal, por até 30 dias em refrigeradores e 12 horas em temperatura ambiente.

O armazenamento das vacinas é ainda mais complicado devido a outro componente importante: a gordura. Em ambas as vacinas, da Pfizer/BioNTech e da Moderna, o mRNA está envolto em bolhas de gordura conhecidas como nanopartículas lipídicas.  Elas fazem o papel de um veículo de entrega, que transporta o mRNA para dentro das células, onde elas começarão o trabalho de produzir a proteína de espícula codificada.

As nanopartículas lipídicas também auxiliam na estabilidade do mRNA ao protegê-lo contra enzimas que degradam o RNA e que são abundantes no nosso corpo e no ambiente. Mesmo assim, com o passar do tempo, as próprias nanopartículas lipídicas podem se degradar ou se agregar e, para uma vacina funcionar, a estrutura de ambos, gordura e mRNA, devem estar intactas ao serem injetadas. “É algo difícil de conseguir”, afirma Verbeke.

Origami genético

Algumas formas naturais de RNA conseguem sobreviver por mais de 12 horas dentro do nosso corpo, conta Rhiju Das, bioquímico computacional da Universidade de Stanford. “Elas são as provas de conceito de que o RNA deve ser capaz de sobreviver por mais tempo nas vacinas”, ele esclarece. E o que essas moléculas robustas de RNA têm em comum são estruturas complexas que comprimem o filamento e evitam que ele se dobre de maneira que possa se dividir em dois.

"O pessoal da indústria tentou usar muitas outras coisas”, afirma Das. Eles tentaram fazer ajustes nas fórmulas lipídicas. Mudaram a acidez das soluções. E mesmo assim não conseguiram encontrar uma maneira de resolver essa questão”, ele lamenta. Mas existe um caminho que não foi explorado: as complexas estruturas de RNA com dobras.

Essa é uma estratégia possivelmente útil para o desenvolvimento de vacinas, porque várias sequências de mRNA podem ser codificadas para a mesma proteína — e cada uma pode assumir formatos diferentes. Sendo assim, se os cientistas conseguirem identificar a sequência que assume o formato mais estável, podem produzir a vacina com exigências de temperatura menos rígidas para transporte e armazenamento.

O truque, porém, é identificar qual seria o melhor origami genético. “O número de possíveis sequências é astronômico”, afirma Wayment-Steele, o que leva a “galáxias de estruturas que uma molécula poderia assumir”. Para restringir as possibilidades, Wayment-Steele e seus companheiros de estudo recorreram a um jogo on-line conhecido como Eterna, que faz uso do potencial das multidões para auxiliar no projeto de RNA através de quebra-cabeças.

Das e seu colega, Adrien Treuille , da Universidade Carnegie Mellon, desenvolveram o jogo há aproximadamente uma década, época em que estavam sempre se deparando com problemas que a inteligência artificial não conseguia resolver. “Em um ato de desespero, decidimos experimentar esse tipo de abordagem de crowdsourcing”, relata Das, que é orientador acadêmico de Wayment-Steele. “O Eterna acabou resolvendo vários problemas difíceis.”

Os usuários do jogo trocam unidades de código genético, chamadas de bases, e o jogo prevê o formato dobrado e estima sua estabilidade. “Às vezes, toda a estrutura [do mRNA] vai mudar apenas com a troca de uma base”, conta Amy Barish, química aposentada e jogadora de Eterna da cidade de Cumming, no estado da Georgia. Depois disso, os cientistas trabalham com os jogadores para desenvolver inteligência artificial, utilizando suas estruturas como exemplos para treinar computadores que prevejam formas mais estáveis de RNA.

Através do trabalho com os jogadores de Eterna, a equipe desenvolveu uma série de sequências de mRNA que codificam a proteína de espícula das variantes B.1.351, P.1 e B.1.1.7 do Sars-CoV-2, identificadas respectivamente na África do Sul, Brasil e Reino Unido, que podem ser duas vezes mais estáveis que as sequências convencionais. Elas estão disponíveis on-line e são gratuitas para desenvolvedores de vacinas, aponta Das.

“É maravilhoso o fato de estarmos trabalhando nesse jogo divertido e desafiador e, ao mesmo tempo, podermos ajudar o mundo”, afirma Barish, que trabalhou em alguns dos quebra-cabeças de proteína de espícula.

No entanto é necessário muito mais trabalho antes que os chamados mRNAs “superdobráveis” possam ser injetados nas pessoas. Uma preocupação antiga é que a suas estruturas talvez impeçam que o motor celular, conhecido como ribossomos, leia e traduza as instruções do mRNA para formar proteínas, explica Maria Barna, geneticista da Universidade de Stanford. Ela uniu forças com o laboratório de Das para testar a tradução dos superdobráveis com o uso de mRNA que codifica um conjunto de proteínas facilmente analisáveis, incluindo uma que emite luz verde. Eles ficaram surpresos e encantados ao descobrir que os ribossomos não apenas desenrolavam as estruturas superdobráveis para produzir muitas proteínas, como também geravam mais proteínas que as estruturas menos estáveis de RNA.

“Esses mRNAs superdobráveis não são apenas um sonho, eles podem realmente funcionar, e funcionam muito bem — melhor do que esperávamos”, afirma Barna.

Ainda é incerto como isso auxiliará na estabilidade da vacina contra a covid-19, mas Barna afirma que eles esperam produzir vacinas que possam ser armazenadas em temperatura ambiente durante um período de semanas, ou mais. A equipe agora colabora com uma empresa farmacêutica para testar estruturas de proteína de espícula superdobráveis em aplicações reais.

Desidratação 

Outra possibilidade de estabilização das vacinas é a desidratação ou liofilização, para que sejam armazenadas em temperatura ambiente na forma sólida. Mas remover a água e, ao mesmo tempo, manter a estrutura do RNA intacto não é uma tarefa fácil. À medida que o líquido congela, o gelo cristalizado pode pressionar a molécula enquanto remove a água, o que pode causar um colapso estrutural.

Uma maneira de evitar essa deterioração é adicionando açúcar. Carlos Filipe, engenheiro químico da Universidade McMaster, com a ajuda de colegas tem testado receitas açucaradas para desidratar vacinas, e a formulação atual depende de dois tipos diferentes de açúcar — trealose e pululano.

A trealose ajuda a preencher espaços vazios na molécula, que se formam conforme a água desaparece, agindo como andaimes que sustentam a estrutura. O açúcar pululano, que serve como base para as fitas de Listerine, encapsula a molécula para impedir que ela se torça, evitando que a estrutura se quebre no meio.

“É como o Hans Solo preso na carbonita”, afirma Filipe, posando como se estivesse congelado, como o personagem fictício de Guerra nas Estrelas, com as mãos à frente do corpo, boquiaberto.

Antes da pandemia de covid-19, a equipe demonstrou a eficácia do tratamento com açúcar para desidratar vacinas contra os vírus da herpes simples tipo 2 e da influenza A, e depois testou as vacinas reconstituídas em camundongos. Junto com o colega Robert DeWitte, Filipe fundou a empresa Elarex, para levar essa tecnologia ao mercado. Agora eles estão trabalhando para testar a mistura para desidratar mRNA encapsulado em nanopartículas lipídicas.

Há inúmeras combinações diferentes de açúcar que podem funcionar, afirma Daan Crommelin, cientista farmacêutico da Universidade de Utrecht, nos Países Baixos. Porém, mesmo com o açúcar, a desidratação ainda pode apresentar alguns desafios. Por exemplo, a desidratação de vacinas poderia aumentar o tempo e o custo de produção, indica Crommelin. Mas esses custos poderiam ser compensados pela eliminação da cadeia de frio, afirma DeWitte, CEO da Elerax.

Ainda mais importante é o fato de que há muitas opções para investigar ou, como afirma Crommelin: “há vários caminhos que levam a Roma”. Mas ele também observa que o velho provérbio precisa de ajustes nesse caso, já que é provável que não será apenas um caminho ou outro. Será necessária uma combinação de esforços para distribuir as vacinas contra a covid-19 para todas as pessoas, independentemente de onde elas estejam.

A próxima onda de vacinas

Versões de uma vacina contra a covid-19 com mRNA mais estável já apontam no horizonte. Atualmente, a Pfizer e a BioNTech recrutam participantes para um ensaio de fase três que avaliará a versão liofilizada da vacina contra o Sars-CoV-2. Espera-se obter resultados no segundo semestre de 2021, para que possam ser submetidos às agências regulatórias para análise.

Outras empresas também possuem novas versões da vacina contra a covid-19 com mRNA líquido, que permanecem estáveis com armazenamento em refrigerador, em vez de congelador. Mas há poucos detalhes disponíveis sobre as razões por trás da estabilidade. A Moderna iniciou um ensaio de fase um para uma versão da próxima geração da vacina contra a covid-19, que eles alegam permanecer estável em refrigerador. Mas, após inúmeros pedidos, a empresa não respondeu perguntas sobre as razões por trás da estabilidade da nova formulação.

A empresa alemã Curevac também afirma que sua vacina é estável em refrigerador por até seis meses e em temperatura ambiente por até 24 horas. A vacina da Curevac, similar a outras do mercado, é encapsulada em nanopartículas lipídicas (NPL) e deve estar protegida para não se partir. “Nós acreditamos que conseguimos esse feito ao embrulhar bem o mRNA dentro da PNL”, afirmou o porta-voz da empresa, Thorsten Schüller, em uma declaração enviada por e-mail para a National Geographic.  “Nossa teoria é que, quanto mais compacto o mRNA estiver embrulhado, haverá menos superfície de ataque.” Ao ser pressionada para fornecer mais detalhes, a empresa respondeu: “é difícil reduzir diferenças de estabilidade a apenas um aspecto”.

Mesmo assim, a diversidade de possibilidades é um sinal animador de melhorias em potencial para as vacinas de mRNA que já estão no mercado. “Esse feito é fantástico”, afirma Verbeke sobre a disponibilização rápida de uma vacina segura e eficiente contra a covid-19. Mas ele complementa: “tenho certeza de que ainda podem ser feitas muitas melhorias”.