Cientistas brasileiros buscam soluções para o combate ao coronavírus

A partir do vírus isolado e de amostras de pacientes, pesquisadores da Universidade de São Paulo estudam novas técnicas de diagnóstico, tratamento e a patogênese do Sars-CoV-2.

Thursday, April 16, 2020,
Por Kevin Damasio
pesquisador Instituto Adolfo Lutz

Pesquisadores da USP realizam o isolamento e cultivo da amostra do SARS -CoV-2, no Laboratório de Virologia do Instituto de Ciências Biomédicas. Já enviado para cinco universidades, o material biológico pode ser utilizado tanto em testes diagnósticos como para estudos em laboratório, por exemplo na busca por tratamento e pela vacina.

Foto de Kevin Damasio

Em meados de março, pesquisadores da Universidade de São Paulo (USP) em Ribeirão Preto (SP) receberam uma encomenda que daria nova dimensão a suas pesquisas sobre o novo coronavírus. Nos pacotes que chegaram ao Laboratório de Virologia, encontravam-se dois frascos que continham o Sars-CoV-2, um com a amostra viável e o outro, inativa, frutos do isolamento viral e cultivo celular realizado pelo Instituto de Ciências Biomédicas da USP na capital paulista. Logo, o grupo de cientistas propagou o vírus em laboratório a fim de criar um estoque e, assim, puderam iniciar estudos que envolvem diagnósticos, tratamento e a patogênese do pivô de uma das mais graves crises sanitárias e econômicas da história moderna.

No interior do estado de São Paulo, o Centro de Pesquisa em Virologia (CPV) divide-se em quatro laboratórios. Um dos quatro grupos de cientistas é focado em vírus respiratórios e coordenado por Eurico de Arruda Neto, professor de virologia do Departamento de Biologia Celular da Faculdade de Medicina desde 1997 e integrante do grupo de trabalho da USP voltado ao novo coronavírus.

“É sempre uma surpresa quando vemos um vírus respiratório ressurgir, ou surgir pela primeira vez, tão avassaladoramente. São muito assustadores”, observa Arruda, que aponta a alta transmissibilidade como a questão que mais choca em relação ao Sars-CoV-2. Antes da pandemia, a equipe de Arruda já realizava estudos sobre os quatro tipos de corona que circulam no Brasil – HCoV OC43, NL63, 229E e HKU1. “Quando a epidemia é de um vírus transmitido por mosquito, precisa exclusivamente dele para ter a transmissão. Quando é de um respiratório, começa a gerar esse pavor porque pode estar em qualquer lugar.”

A busca por tratamentos eficazes contra o Covid-19 está entre as principais preocupações de cientistas no mundo inteiro. Fora do contexto de epidemia, o processo de pesquisa e aprovação de novas drogas terapêuticas é um “sistema abrangente”, destaca Arruda. Após um screening – a busca virtual de moléculas –, os compostos bioativos que demonstrarem potencial de inibição do vírus são selecionados, analisados em laboratório e, posteriormente, submetidos a estudos pré-clínicos e clínicos. O processo pode levar meses, senão anos. É o que acontecerá para identificar um tratamento específico para a Covid-19.

“Numa situação de emergência como a nossa, não dá tempo para fazer tudo isso”, considera Arruda. Por isso, cientistas no mundo todo buscam, em meio aos inúmeros fármacos já licenciados para uso terapêutico em outras patologias, aqueles que podem funcionar no tratamento da doença provocada pelo novo coronavírus. São as chamadas “drogas de redirecionamento”.

No Laboratório de Patogênese do Vírus no CPV, há uma biblioteca de produtos com cerca de 2,5 mil drogas já licenciadas para uso clínico. Para identificar possíveis antivirais, os cientistas colocam esses fármacos em pequenas cavidades de uma placa com células e comparam o comportamento ao de outra cultura celular que não teve contato com o composto. “Se na presença da droga o vírus se replicar menos, significa que tem potencial como inibidora”, explica o virologista. Após essa sinalização, identifica-se qual composto bioativo propiciou tal comportamento e é analisado por que mecanismo de ação ele atua. Com isso, aprofunda-se o estudo para entender se seria possível utilizá-lo para tratamento clínico.

“Numa situação de emergência como a nossa, não dá tempo para fazer tudo isso [o longo processo de estudos clínicos e pré-clínicos].”

por Eurico de Arruda Neto
Professor de virologia do Departamento de Biologia Celular da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo

O novo coronavírus usa como receptor a enzima conversora de angiotensina 2, importante mecanismo de controle da pressão arterial, observa Arruda. “É possível que, por exemplo, drogas para o tratamento de hipertensão tenham efeito nesse vírus. Elas estarão incluídas no nosso screening, mas seu potencial não foi comprovado ainda.” Os testes com os 2,5 mil fármacos devem começar nesta semana.

Outros exemplos são o da cloroquina e seu derivado, a hidroxicloroquina. Utilizados no tratamento de malária, os remédios inibem a entrada na célula de “qualquer vírus envelopado que entre pela linha docítrica”, observa o virologista. “Se algum vírus liga em uma célula e, para entrar nela, depende que a célula faça a endocitose do vírus, esse vírus pode ser inibido por cloroquina, porque ela inibirá a acidificação do endossomo, que precisaria ficar ácido para liberar a entrada do vírus.”

A hipótese da eficácia da cloroquina no tratamento da Covid-19 foi levantada pelo professor francês Didier Raoult, diretor do Instituto Hospital Universitário Méditerranéee de Marselha. O microbiólogo relatou os testes em algumas dezenas de casos e disse que o resultado foi satisfatório. Entretanto, Arruda ressalta que não se trata de um experimento controlado. Ainda não há consenso científico sobre a eficácea deste fármaco. Por isso, pesquisadores diversos países, entre eles o Brasil, têm realizado novas pesquisas com a droga. “Um estudo, para ser bem feito, tem que dar a droga para um grupo e, para o outro, placebo – algo que o paciente pense que é a droga, mas não é –, para saber o real efeito. Isso não foi feito nesse estudo da França.”

Diagnóstico e patogênese

Os pesquisadores da USP de Ribeirão Preto também buscam novos métodos de detecção do vírus. Eles iniciaram um ensaio de teste rápido baseado na espectrometria de massa, capaz de identificar os peptídeos das proteínas virais na secreção do paciente – biomoléculas formadas por dois ou mais aminoácidos. “Quando se bombardeia uma proteína, ela se desfaz nos fragmentos dos tijolinhos que a compõe, que são os aminoácidos”, explica Arruda. “Do jeito que se desfazem e pelos grupos que se formam, dá para dizer exatamente qual é aquela proteína, se é a do Sars, em questão de minutos, por meio do espectrômetro de massa.”

Espectrômetros de massa são instrumentos de detecção e identificação de moléculas, presentes em hospitais e em alguns centros de pesquisa. Portanto, Arruda considera que o teste rápido serviria sobretudo para o diagnóstico de pacientes internados. “Seria um jeito bom de ajudar, porque os laboratórios estão inundados de amostras e não conseguem dar as respostas rapidamente, já que o método PCR [proteína C-reativa] dá muito trabalho e leva pelo menos um dia entre a preparação da amostra e o resultado.”

Outra técnica pesquisada pelos cientistas que também resultaria em um diagnóstico mais rápido pode ser desenvolvida através de anticorpos produzidos por animais. Para obtê-los, primeiro a amostra do vírus é inativada para perder a infecciosidade. Depois, o vírus é injetado na barriga de um camundongo, o que induzirá a produção dos anticorpos. Depois, é possível extraí-los no soro sanguíneo do animal. Segundo Arruda, levará ao menos um mês para obter esses anticorpos e testá-los até comprovar o funcionamento. “Se tiver a secreção do paciente, contendo células que estão infectadas pelo vírus, é possível fazer uma imunofluorescência. Em uma lâmina, resolve-se muitas amostras por esta técnica. Usamos esses anticorpos como reagentes. Esse é um método de detecção de antígenos, em vez da detecção de ácido nucleico da PCR”, conta Arruda.

O virologista observa que a descoberta de anticorpos neutralizantes também poderá auxiliar no tratamento de pacientes em estado grave. A infusão do plasma de um paciente convalescente – já curado da Covid-19 – poderia fornecer anticorpos para uma pessoa em estado grave. “Estamos fazendo um ensaio para dosar o anticorpo no soro do doador, para ver se é neutralizante e, assim, poder usá-lo.”

Já a patogênese de vírus respiratórios é o principal foco de estudos no laboratório de Arruda. Trata-se do mecanismo pelo qual o vírus causa suas respectivas doenças. Nesse campo científico, um dos métodos de pesquisa é infectar, com o vírus, amostras de células sanguíneas de humanos saudáveis fora do corpo. No caso do Sars-CoV-2, os pesquisadores trabalham com leucócitos do sangue periférico – os glóbulos brancos. Assim, pode-se analisar a reação inflamatória que o vírus induz nas células humanas. Além disso, é possível verificar se há produção de mediadores inflamatórios capazes de agravar quadros de pneumonia. Essa complicação é comum entre os 20% de casos graves de pacientes com Covid-19.

“Eu não estava com expectativa de que esse vírus pudesse causar tanto estrago. Confesso que nossa preocupação aumentou bastante quando começou uma expansão muito grande na China, sendo que não é comum que esse tipo de vírus se espalhe desse jeito.””

por Edison Luiz Durigon
Coordenador do Laboratório de Virologia Clínica e Molecular do IB-USP

“Já se sabe que na pneumonia tem um afluxo muito grande de neutrófilos para o pulmão. Eles produzem a chamada NAT, redes de DNA da cromatina do neutrófilo, que jogam para fora para englobar bactérias e fungos”, observa Arruda. “Vamos investigar se esse vírus faz isso porque, aparentemente, a imagem de tomografia mostra que é semelhante a uma pneumonia por outras causas.”

O estudo da patogênese também pode ser feito em animais de laboratório que tenham os receptores, como o hamster, ou em tecido ex vivo, extraído de humanos e cultivado em laboratório. “Eu pego um pequeno fragmento de uma amígdala de uma criança e cultivo aquilo. Quando coloco o vírus nesse pedaço de tecido, vejo por onde entrou, para onde foi, que células infectou”, exemplifica Arruda. “Só não fizemos ainda porque todas as cirurgias eletivas foram canceladas. Em breve, quando obtivermos novos tecidos, conseguiremos estudar.”

Isolamento e cultivo do vírus

Os primeiros casos de pacientes infectados pelo novo coronavírus vieram à tona em Wuhan, na China, em dezembro de 2019. Naquele primeiro momento, Edison Luiz Durigon conta que o então surto não chamou tanto a atenção dele e dos outros pesquisadores do Laboratório de Virologia Clínica e Molecular, do Instituto de Ciências Biomédicas (ICB) da USP. “Eu não estava com expectativa de que esse vírus pudesse causar tanto estrago”, diz Durigon, professor de virologia e coordenador do laboratório. “Confesso que nossa preocupação aumentou bastante quando começou uma expansão muito grande na China, sendo que não é comum que esse tipo de vírus se espalhe desse jeito.”

O laboratório do Instituto de Ciências Biomédicas da USP conseguiu recursos para aprimorar sua infraestrutura, com equipamentos, insumos e pessoal, durante a epidemia do zika vírus em 2015. Depois, os pesquisadores expandiram o trabalho e as metodologias em estudos sobre a febre amarela, a dengue e o surto de sarampo que persiste até hoje.

“Essa equipe está muito afinada. Temos técnicas estabelecidas, o isolamento viral, a cultura celular e nossas técnicas sorológicas em bom funcionamento. Por isso conseguimos rapidamente isolar o vírus”, me contou Danielle Bastos, no escritório do laboratório em que é pós-doutoranda. A médica veterinária tem centrado sua carreira nos estudos de zoonoses e arboviroses.

“Foi até uma coincidência. Na semana que teve o primeiro caso no Brasil, eu estava cultivando outro coronavírus, o sazonal NL63”, acrescentou a biomédica Danielle Bruna, doutora em microbiologia e especialista em vírus respiratórios. “Já estava em célula quando o doutor João Renato [Rebello, médico do Hospital Albert Einstein] avisou que tinha o primeiro caso positivo [em São Paulo] e perguntou se a gente queria isolá-lo.”

O hospital particular havia enviado uma amostra para o Instituto Adolfo Lutz, encarregado de fazer a contraprova do teste diagnóstico. Já os cientistas do laboratório do ICB receberam a amostra em uma manhã de sábado, 29 de fevereiro.

Trabalhos com vírus respiratórios exigem laboratórios de contenção com nível de biossegurança 2 (NB2). Porém, por se tratar de um tipo exótico, o processo de isolamento viral e cultivo celular do novo coronavírus teve de ocorrer no de NB3 – uma categoria de controle ainda mais rígida. Nele, os cientistas utilizam roupas especiais e EPI completo – máscara, touca, óculos, avental para pé e duas luvas. Sempre trabalham em duas pessoas. Uma fica no “fluxo” dos experimentos e a outra na instrumentação, para evitar acidentes de trabalho, erros de pipetagem e contaminação, explica Bruna.

O primeiro passo do processo do isolamento consiste no tratamento da amostra. Faz-se uma filtragem com antibiótico, a fim de livrá-la de qualquer tipo de contaminante e garantir que só exista o vírus. O cientista, então, extrai o RNA do vírus, ou ácido nucleico. O material é colocado em frascos que depois são inseridos em uma máquina similar a uma impressora. Nela, adiciona-se um reagente às placas com ácido nucleico e ocorre outra etapa de extração para a obtenção do material genético. Depois, é feito o “aquecimento da garrafa” que contém a célula de eleição, neste caso, a Vero-E6, extraída do rim de macaco verde africano.

A amostra do Sars-CoV-2 foi, então, inoculada na célula e colocada dentro de uma estufa, onde dissolveu em um ambiente a 37°C com 5% de CO2 para simular as condições do corpo humano. A cada 15 minutos, os cientistas mexiam na amostra para garantir o contato entre o inóculo e o tapete celular. Após uma hora na estufa no processo de dessorção celular, completaram a “garrafa” com 30 mL de meio de cultura – uma substância que contém os nutrientes necessários para que a célula cresça e, com isso, seja estimulada a receber o vírus, explica Bastos. Em 24 horas, os pesquisadores observaram por microscópio que o Sars-CoV-2, de fato, replicou-se, isto é, houve contaminação da célula, além de seus efeitos. Em 3 de março, os pesquisadores do ICB concluíram o isolamento viral e o cultivo celular do Sars-CoV-2.

“Imagina que eu chegue aqui com 200 microlitros (µL) de uma amostra raríssima. Se eu não aumentar essa quantidade de vírus, não tenho como produzir controles para o país inteiro, nem para que outras pessoas façam testes de vacina e drogas”, observa Bruna. “O que fizemos foi ampliar essa quantidade de vírus, para que possa ser usado em outros trabalhos.”

As amostras dividem-se em dois tipos de inóculo. O inativado contém o vírus não infeccioso. Essa amostra serve para uso em testes diagnósticos de Covid-19 como o PCR-TR, estudos de biologia molecular e sequenciamento do genoma. É colocado um tampão sobre a partícula viral, para manter o ácido nucleico íntegro, uma vez que vírus de RNA normalmente se degrada rapidamente.

O segundo tipo é o viável, armazenado a -80°C em nitrogênio líquido para que a partícula viral não se rompa. “Precisamos dele íntegro, para que suas espículas [estrutura na superfície do envelope viral] encontrem os receptores das células. Assim, outras pessoas também conseguem ampliá-los em seus laboratórios e fazer seus experimentos”, conta Bruna. Esta amostra serve para um amplo campo de pesquisas, como “descoberta de drogas para tratamento, ou infectar células neurais, para ver se há alguma relação com doenças neurológicas”.

Na época em que isolaram o vírus, havia no Brasil apenas transmissão local, com poucos casos de pacientes infectados fora do país ou contaminados por pessoas que vieram de fora. Nesse contexto, as amostras do vírus eram importadas para serem utilizadas por laboratórios, hospitais, universidades e instituições como o Instituto Adolfo Lutz e a Fundação Oswaldo Cruz. Dias antes de isolar o vírus, os pesquisadores do ICB haviam recebido da Alemanha uma amostra cuja importação custou R$ 12 mil.

Até esta quarta-feira, 15 de abril, 23 amostras do material viral foram enviadas em quatro operações realizadas pelos Correios. Receberam os insumos laboratórios da USP de Ribeirão Preto, das universidades federais de Minas Gerais (UFMG) e Rio de Janeiro (UFRJ), a Estadual de Campinas (Unicamp) e a Feevale de Novo Hamburgo, Rio Grande do Sul.

Os Correios têm fornecido apoio logístico à Rede Vírus, do Ministério da Ciência, Tecnologia, Inovações e Comunicações. Cada amostra biológica é despachada em uma caixa especial, de papelão com isopor e repleta de gelo seco. O frasco – de 500 µL para as amostras viáveis e 1 mL para as inativas – é vedado em plástico. “A logística é dotada de altos requisitos de segurança e agilidade, para que o material seja entregue em até 20 horas após a coleta, em perfeito estado de conservação e com risco zero de contaminação, tanto de pessoas quanto do ambiente por onde as amostras transitam”, informou, em nota, a empresa à National Geographic.

A ciência dos coronavírus

Os pesquisadores do ICB atualmente avançam com suas primeiras pesquisas. “Já padronizamos o teste de neutralização viral, ou sorologia, e estamos iniciando a testagem de pacientes para o estudo de tratamento com plasma de recuperados em alguns hospitais”, me contou Bastos, na última quarta-feira, 8 de abril. “Também iniciamos outros experimentos com esta sorologia, como a comparação com testes rápidos de detecção de anticorpos para o vírus.”

Os cientistas também se amparam no conhecimento sobre as quase duas dezenas de vírus respiratórios que estudam no laboratório. Bruna destaca que o primeiro ponto em comum entre eles é a sazonalidade. “Vírus respiratórios se propagam melhor em climas frios ou úmidos. No Norte, a maior transmissibilidade é em novembro, dezembro e janeiro, a época das chuvas que lá chamam de inverno”, analisa a biomédica. “No Sul e Sudeste, do outono ao início da primavera. Temos alguns que circulam no verão em menor quantidade, mas os mais comuns são os enterovírus, os que causam diarreia e são muito comuns em resorts, navios, piscinas de clube.”

Do final de março a junho, observa-se sempre a maior presença do RSV, o vírus sincicial respiratório, que causa SRAG principalmente em crianças. Já o influenza ocorria do final do inverno ao início da primavera. Contudo, depois da pandemia de 2009, o período de incidência maior agora acontece a partir do outono.

Dos quatro tipos de coronavírus que já circulavam no Brasil, apenas o NL63 costuma aparecer no verão. Os demais são comuns do outono até o início da primavera. “Todos os quatro coronas sazonais são leves e não são responsáveis por pneumonias graves, a não ser quando associados. Por exemplo, uma co-infecção de dois vírus, sendo um deles corona, pode levar à hospitalização. Mas normalmente você nem chega a ir ao médico, porque é uma doença de vias aéreas superiores que só provoca gripe”, observa Bruna.

Eurico de Arruda Neto acredita que o conhecimento sobre os outros tipos de corona pode servir de base no início dos estudos sobre o novo vírus, enquanto a ciência sobre o Sars-CoV-2 segue em desenvolvimento. “Sabemos que os outros coronavírus persistem”, conta o virologista da USP de Ribeirão Preto. “Significa que, mesmo depois que a infecção aguda passou e que o paciente está curado, o vírus não se acabou. Fica ali por um tempo bastante longo até, que pode ser de alguns anos. Se esse novo coronavírus persistir, pode ser que o paciente se cure, não tenha mais sintoma, mas siga eliminando o vírus e sendo fonte de contágio para outras pessoas.”

Este comportamento é comum nos coronas 229E, OC43, NL63 e HKU1, observa Arruda. Entretanto, o virologista ressalta que ainda não se sabe se o mesmo ocorre com o Sars-CoV-2. “É uma das coisas que vamos averiguar, mas não é para agora. É para quando a pandemia passar, em uma análise a partir do tecido de pessoas.”

Em 2019, Arruda foi co-autor de um estudo sobre o perfil das infecções respiratórias agudas em crianças, responsável anualmente pela morte aproximadamente 160 mil recém-nascidos e 760 mil crianças. Os pesquisadores constataram que os coronavírus estão relacionados a doenças graves em crianças com menos de dois anos de idade. A pesquisa foi publicada em junho passado no Plos One. “Dentre os vírus respiratórios, o coronavírus foi o que mais se associou com admissões de crianças em UTI pediátrica, por causa de infecção respiratória”, observa Arruda. “Antes, eram considerados vírus de um resfriado mais forte. No bebê e na criança pequena, ainda lactantes, há possibilidade de causar doenças mais graves.”

Com o Sars-CoV-2, a situação já se mostra diferente. Os quadros mais críticos de Covid-19 se manifestam principalmente em idosos e pessoas com comorbidades como hipertensão, diabetes, asma. Dados do Sistema Nacional de Vigilância da Gripe, do Ministério da Saúde, apontam que 77% das vítimas de Covid-19 no Brasil tinham mais de 60 anos e 75% possuíam ao menos uma doença crônica.

“Geralmente, as mutações acontecem nos vírus com o objetivo de atenuá-los”, observa Arruda. “Ao longo da evolução, tendem a se adaptar a seus hospedeiros. Querem se replicar, mas causando o menor dano possível, porque são parasitas intracelulares obrigatórios que dependem da célula do hospedeiro.”

A mutação que torna ao vírus mais agressivo geralmente é consequência de um pulo de espécie, continua Arruda. O Sars-CoV-2 estava adaptado ao organismo do morcego. Porém, mudou de comportamento tão logo passou para as pessoas e levará muitas gerações do vírus até se atenuar e ser menos nocivo.

“Acredito que veremos o mesmo que aconteceu com a gripe suína, o H1N1. No começo, foi aquele alvoroço, depois virou um vírus sazonal, tanto que agora faz parte da vacina de gripe”, aposta Arruda. Em um estudo publicado em fevereiro no Journal of Virology, Arruda e outros pesquisadores da USP de Ribeirão Preto e da Universidade de Geórgia identificaram que o H1N1 já sofreu mutações a ponto de agora habitar, silenciosa e permanentemente, em amígdalas de crianças, sem provocar doença. “Na minha opinião, o Sars-Cov-2 também vai se adaptar.”

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